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哲学观点: “做细胞科学”

J.Lippincott-Schwartz,J.细胞科学(2000) 113: 1499-1500

在这张显微照片中,磷光蛋白突出了复杂的细胞结构作为细胞生物学家,重要的是不断提醒我们自己细胞组织和功能的目的,并尊重进化的独创性和微妙性。当面对未解决的问题时,我发现依靠三个基本课程来帮助整理一大堆数据和相互冲突的理论特别有用: 细胞功能在历史上是为了细胞繁殖、生存和/或适应而选择的;这些功能来源于许多作为功能单元的蛋白质,不能仅仅通过分析单个蛋白质的细节来理解; 细胞生物学的进步和生产力依赖于从许多角度重叠和强化数据,而不是单一的孤立调查路线。

细胞进化的教训。与无生命系统不同,细胞的功能系统是出于某种目的而被选择的,并且有一个完整的历史可以追溯到生命的起源。新的功能只能通过修补现有的生物机器而产生,而不是从头开始建造。因此,当研究任何新的过程或现象时,询问它可能进化出的或与之相关的其他功能是很有用的。我想到的一个例子是膜再密封,这是一种直到最近才被描述出来的现象 (McNeil 和 Steinhardt,1997)。细胞的质膜不断被撕裂或破坏,必须重新密封。毫无疑问,膜再密封是一种古老的细胞功能,因为没有它,细胞含量和完整性就无法维持。最近的研究表明,再密封涉及 Ca + 介导的内体膜与质膜的融合,而不是质膜膨胀以填充穿孔区域 (Terasaki 等人,1997)。这一发现提出了一个问题,即是否有其他 Ca + 介导的与质膜融合的过程,包括突触囊泡融合 (和来自内体的突触囊泡生物合成), 已经发展成为更基本的伤口愈合过程的专门适应。通过询问不同的过程是如何相互关联以及细胞的历史演变,系统的基本属性通常可以被识别并用于产生可测试的假设。

涌现的细胞特性。作为细胞生物学家,我们一直忙于将功能分配给蛋白质或基因,并将生物现象减少到单个分子的行为。尽管这种方法看起来是成功的,但它对于理解许多细胞生物过程有显著的局限性 (Hartwell 等人,1999)。离散的生物功能只能很少归因于单个分子。相反,大多数生物功能产生于许多成分之间的相互作用,并且通常是以一种无法从单个成分的活动中预测的方式。一个例子是肌动蛋白细胞骨架的功能,它产生于大量相互作用分子之间的相互作用,这些相互作用分子在不同的细胞位置调节肌动蛋白组装/拆卸的动力学 (Theriot,2000)。这样做,它们允许肌动蛋白的聚合/解聚状态之间发生快速转变,这反过来又是定向细胞或细胞器运动的基础。这个系统的集体属性,而不是任何单一的组件,是它功能的基础。因此,为了理解肌动蛋白细胞骨架的功能,我们需要知道是什么驱动了肌动蛋白稳定状态之间的快速转变,它的动力学参数,以及任何特定状态是如何保持的。这项工作将需要新的方法来定量描述和模拟大量相互作用分子的活动。

对细胞生理化学性质的评价对于理解细胞结构是如何组织和维持的至关重要。例如,肌动蛋白和微管蛋白作为灵活、调节的聚合物阵列的涌现特性,可能是这些蛋白质在细胞骨架的许多活动中的进化选择的基础。细胞远离平衡,从环境中获取能量。因此,许多细胞结构是由自由能变化驱动的自组织系统。这些包括有丝分裂纺锤体,以及肌动蛋白和微管蛋白的聚合阵列。不太为人所知的是高尔基体复合体,它是分泌运输中的蛋白质分类和处理站。最近的研究描述了在有丝分裂期间高尔基体的分解/重组以及对活细胞中细胞扰动的反应 (Storrie 等人,1998; Shima 等人,1998; Zaal 等人,1999),然而, 符合这种细胞器的自我调节性质。对于像高尔基体这样的膜细胞器来说,除了蛋白质-蛋白质相互作用之外,它们的膜的物理性质也是它们蛋白质分类和保留能力的基础。这样的特性包括由特殊类型的脂类引起的膜弯曲,脂类和蛋白质分离成微区,以及张力驱动的膜流 (Mui 等人,1995; Bretscher 和 Munro,1996; harder 等,1997; Sciaky 等,1997)。因为这些特性作为一个整体促进了高尔基体最基本的功能特性 (即蛋白质分类和保留), 需要设计更好的方法来表征这些特性及其与分泌运输所需的蛋白质机制的关系。

通过共聚焦显微镜捕获的真核细胞多学科方法。因为细胞非常复杂,有许多相互作用的成分,所以警惕从单一调查中得出的结论或模型是很重要的。细胞功能模型必须通过多角度的结果和使用广泛的技术来加强,包括分子生物学、生化遗传学和高分辨率和低分辨率的成像。研究人员倾向于推断出宏大的结论,这是可以理解的。然而,作为一名科学家的部分工作是要有足够的纪律,通过多种技术和方法来验证假设。通过这种方式,一个特定的假设可以与其他系统中的观察结果相联系,创建了一个相关观察结果和建议函数的网络,这些网络一起解释了大量数据。仅仅从暗示替代功能的单一方法获取数据,与其他调查途径隔离开来,可能会产生误导,需要使用广泛的调查工具进行核实。金博宝188登录

展望未来,我的感觉是,对细胞行为进行定量预测和测试对于验证我们的细胞功能模型至关重要。这将需要整合许多实验方法,如体外重建、原位成像和数学建模,以便将不同水平的分析联系起来 -- 从分子,通过功能性分子组装,到细胞。这样,管理细胞结构和行为的紧急原则及其进化限制,可以被理解并用于解决细胞在发育、健康和疾病中的作用。金博宝188登录

通过成像合并以结构和过程为中心的视图金博宝188登录

光学显微镜成像技术使得连接以结构和金博宝188登录过程为中心的研究策略成为可能,因为它能够提供结构决定因素和与细胞和组织相关的输出之间时空关系的定量描述。这些描述可以用于开发过程及其设计原则的构建和测试模型。在过去的十年里,发育生物学中的许多关键发现都受益于这种方法,经常揭示组织功能、组织和发育背后意想不到的细胞行为。例如,观察上皮形态形成的器官型培养的 3D 延时成像揭示了集体细胞迁移和异型细胞相互作用的新作用 (Ewald 等人,2008)。此外,来自物理力量的机械输入已被证明可以作为影响基因表达、调节细胞过程和控制组织组织的信号 (小林和索卡贝,2010)。此外,形态动力学过程,包括细胞伸长、极化和收缩,已被证明是上皮闭合、组织伸长和神经系统形态发生等多种多样过程的基础, 以及干细胞维持和肿瘤进展 (Skoglund 和 Keller,2010)。这些新发现,虽然依赖于遗传和生化方法来识别新分子,但只有通过多维成像观察潜在关系的结果才有可能。

持续的进步正在推动光学显微镜成像在发育生物学中的不断扩大的应用。多个技术前沿的进步允许实验能力跨多个空间和时间尺度询问发展系统。显微镜系统的改进金博宝188登录允许探测发育过程中整个生物体的精细超微结构或细胞动力学的可视化。此外,自动化和图像分析的进步使得快速筛查和大规模解剖重建成为可能。这些成就来自于荧光标记、功能指示器和荧光标记的遗传策略的扩展,以及光学和计算技术的改进。

荧光蛋白技术进展

用于可视化的荧光标记的增加尤其令人印象深刻。最重要的是来自 Victoria Aequoria 及其亲属的基因编码绿色荧光蛋白 (GFP) (Tsien,1998)。这些蛋白质可以融合到几乎任何感兴趣的蛋白质上,并在不同的显微镜技术中用于在许多空间尺度上可视化细胞过程。荧光融合蛋白很容易构建,显示出特异性的靶向性,并且与使用荧光抗体或外源染料的早期方法不同,对生物样本的干扰最小。它们的高灵敏度是由与照明光不同颜色的光产生的,允许细胞过程在几秒钟、几分钟或几天内被准确监控。实验室诱变使 GFP 的光谱多样化,提高了其亮度和折叠效率,并产生了不同的颜色,这使得细胞内的多组蛋白质可以同时成像 (Shaner 等人, 2007)。诱变也导致了可光活化或可光转化的绿色荧光蛋白形式的产生,这使得突出特定的蛋白质群体来检查周转和命运映射成为可能 (Lippincott-Schwartz 和 Patterson, 2009)。最后,来自海洋珊瑚的荧光蛋白 (FPs) 由于其长波长,已经发生了变异,产生了一系列在深层组织成像中有用的红移蛋白 (Fradkov 等,2000)。金博宝188登录

这种具有不同颜色和行为的工程 FPs 的可及性导致了一整个特定实验策略领域的出现,以阐明蛋白质的空间区划和时间动力学。在具有定量影响的成像技术中,有光漂白后荧光恢复 (FRAP) 、光激活、荧光相关光谱复制 (FCS) 、荧光共振能量转移 (FRET) 、和荧光寿命成像 (FLIM) (Lippincott-Schwartz 等人,2003; Miyawaki,2011; Digman 和 Gratton,2011)。在每一种情况下,在细胞中指定区域内 FP 信号的变化会洞察金博宝188登录到融合蛋白的扩散、结合/分解动力学、寿命、构象变化, 和/或分子间的相互作用。这使得研究人员能够以前所未有的方式询问和量化细胞和组织中的蛋白质相互作用和关系。虽然总是需要谨慎以确保 FP 标签不会影响蛋白质的行为,但值得注意的是,有多少用 FPs 标记的不同蛋白质显示出与其内源性对应蛋白质相同的行为。

从这些成像技术中获得的关于蛋白质行为和细胞内动力学的新信息对于破译驱动细胞和发育过程的复杂途径非常有益。金博宝188登录

一个例子是在信号转导领域,基于 FRET 的方法允许监测信号分子之间的调节相互作用 (Mehta 和 Zhang,2011)。FRET 允许在活细胞中实时检测小于或等于 100 A 的蛋白质相互作用 (取决于信号产生时从供体到受体的能量转移)。因此,可以探测与蛋白质相关的分子间和分子内距离,以及短时间内的短暂蛋白质-蛋白质相互作用 (在需要大的可分离分数的经典生化方法中经常被忽略) (Miyawaki,2011)。通过在 FP FRET 对之间放置构象敏感的蛋白质,例如基因编码的钙或 PKC 活性报告基因, 关键信息已经出现,用于理解信号分子如何作为电路相互连接来控制信号流的动力学 (Mehta 和 Zhang,2011)。此外,将数据输入数学模型有助于揭示信号通路的复杂特征,包括负反馈、双稳态和振荡信号动力学。金宝搏官方

除了报告蛋白质的动力学,FPs 还可以作为生物传感器用于检测不同的细胞状态 (张等人,2002)。该类别中的最新探针包括用于监测 GTP 水解、钙信号和细胞周期事件的探针。FP 探针也被设计用来扰乱离散的生化活动。通过改变蛋白质的分布或相互作用,这些探针允许特定的生物活性在细胞中选定的时间和地点被改变。一种策略包括对 FPs 进行修饰,使其结合能够二聚化的小分子,这触发了蛋白质行为的改变 (Karginov 等,2010)。另一种令人兴奋的方法涉及最佳诱导开关,它利用光来离散地激活信号分子 (Gorostiza 和 Isacoff,2008)。

基因编码的 tar-get 与合成荧光团的耦合比 FPs 小得多,这提供了标记蛋白质的可能性,否则当融合到 FP 时,这些蛋白质会错误地折叠或折叠 (ferna 'ndez-sua' rez 和 Ting,2008)。在这种方法中,能够招募一个小的合成荧光分子的肽或蛋白序列通常在活细胞中表达。被证明是成功的技术包括 SNAP 标签 (Campos 等人,2011) 以及那些被称为 FlAsH 和 ReAsH (Machleidt 等人,2007)。在 FlAsH 和 ReAsH 中,添加一个小的荧光分子来结合到基因靶中设计的半胱氨酸残基上,点亮目标,允许其动力学成像。使用 ReAsH,可以执行相关的光学和电子显微镜 (EM),因为它能够产生特定的光氧化反应,产生在 EM 中可见的电子密集信号。

小分子荧光探针也被用于报告技术,用于探测代谢物的天然生物化学,包括锌和一氧化氮等离子,它们驱动许多生理过程,或者,当不受控制时, 触发病理学 (Zhang 等人,2002; Pluth 等人,2011)。锌指示剂通常是基于强度的传感器,通常与荧光素相关,与锌配合,荧光发射强度增加。另一方面,一氧化氮探针包括一氧化氮的氧化产物与官能团反应来调节其荧光的探针。利用这些和其他指标,关键代谢物的产生、积累和转运正在以空间和时间分辨率进行研究,揭示了它们如何对特定输入做出反应 (Pluth 等人, 2011)。这是桥接结构和过程方法,通过阐明已知利用有机物种的多种酶和途径相互关联并调节生物系统的不同方面。

显微镜的进展: 衍射限制

与仅十年前的类似显微镜相比,当代光学显微镜几乎在所有参数上都进行了修改,使成像能够在前所未有的空间尺度和实验环境中进行。由于关键的改进,现在可以获得约 120 图像/秒甚至更高的图像采集速度,并且由于光谱发射重叠的最小化而具有多光谱成像。结合这些改进的显微镜系统包括商用光扫描共焦、旋转圆盘共焦和具有全内金博宝188登录反射的宽视场显微镜。这些系统中的许多都有用于执行动力学实验的内置宏,如 FRAP 、 FRET 或 FCS。此外,自动化和图像分析的进步使得使用这些显微镜平台进行快速筛查和大规模解剖重建成为可能。

除了具有更明亮的激光和更快的成像,现代共焦和旋转磁盘系统能够对样品的特定区域进行分析。这使得研究人金博宝188登录员能够选择性地对样本进行光活化或光活化。通过以这种方式突出显示蛋白质群体的离散池,可以可视化和量化蛋白质的整体稳态动力学,包括其周转动力学和运输途径。通常,惊人的特征被观察到,例如与膜复合物和核仁相关的蛋白质的快速结合/解离动力学 (Lippincott-Schwartz 等人,2003)。这些动力学在从常规成像或生化分离方法获得的蛋白质的稳态表征中并不明显。所获得的知识是通过揭示大分子结构如何与组件的组装、流动和周转联系在一起的结构和过程营。

现代显微镜令人印象深刻的技术创新也延伸到对整个活生物体的研究。由于光散射,传统的共焦显微镜通常允许对组织进行不超过 44毫米深的成像。但是许多与理解组织和发育功能相关的重要过程发生的比这更深,所以科学家们正在努力推进显微镜的深度分辨率能力。双光子显微镜是实现增加样本深度穿透的一种强有力的方法 (Helmchen 和 D金博宝188登录enk,2005)。它使用比可见光更深的近红外照明,将两个或更多的传入光子转换成不同颜色的传出光子。激发体积的空间限制允许对具有固有光学切片的样本进行深度成像。为了允许在厘米范围内对组织进行深度成像,双光子成像可以与显微内窥镜相结合, 它采用了一种由薄而坚硬的光学探针组成的显微内窥镜,该探针插入组织中以引导光线进入或从深层组织位置传播 (弗洛斯伯格等人,2005)。通过扫描组织外部的激光焦点,探针装置投射并将扫描图案分解到组织内部的焦点平面。这样,就有可能在整个有机体的背景下获得细胞特性, 例如在内脏器官的腔中或在毛细血管的路径中 (Monfared 等人,2006)。

平面照明显微镜为体内体积荧光成像提供了进一步令人兴奋的可能性 (Huisken 等人,2004)。在这种方法中,照明来自一张由圆柱形透镜产生的 2--8 微米厚的激光光片,通常具有适度的数值孔径 (NA) 和金博宝188登录较长的工作距离。光学切片是通过在不同方向转动样品来实现的,以允许激光片照亮连续的平面。这使得非常厚的标本,包括完整的胚胎,能够以高速和低光照完全成像, 正如一项关于正在发育的 Medaka 鱼胚胎的基因和蛋白质表达模式的精妙研究所显示的那样,该胚胎成像了几天 (Keller 等人,2008)。除了胚胎发育,利用平面照明显微镜的成功应用还包括涉及解剖制图、粒子追踪和神经活动功能成像的研究 (Holekamp 等人,2008)。金宝搏官方

因为在平面照明显微镜中的光片的厚度在视场上有很大的差异,直到最近,这种技术才被限制在多细胞、微米级的领域。然而,随着使用贝塞尔光束来制造更薄的光片,现在有可能将平面照明显微镜扩展到亚细胞、纳米网格水平域 (Planchon 等人, 2011)。贝塞尔光束的产生是通过在激励物镜前定位环形切趾掩模来完成的。这创建了一个小于 0.6毫米的薄光片,可以快速扫描超过 60 3 80毫米的视野。由此产生的 3D 高速活细胞成像 (即,每个图像平面 10 MS) 是前所未有的,并且可以提供细胞内和细胞间 3D 组织的惊人的延时序列。这一进展有望在阐明复杂组织中细胞相互作用的动力学和关系的许多方面产生重大影响,而其他方法,如双光子和传统的光板平面显微镜,由于他们有限的 z 分辨率和较慢的光学切片速度。金博宝188登录

深部组织成像的另一个显著改进领域是荧光信号检测。由于光学金博宝188登录失真,衍射限制成像很少在厚标本深处实现。这些是由于样品内折射率不均匀性导致激发和检测途径异常而产生的。自适应光学领域的新方法正在帮助纠正这个问题 (Booth 等人,2002)。一种策略是使用后物镜的分割,使得信号和空间分辨率在高达 400毫米的深度有显著提高 (Ji 等人,2008)。与光学清除试剂结合使用,以进一步缓解组织内的光散射,甚至可以获得更好的分辨率。

这些深部组织成像的各种改进与桥接结构和过程的两个阵营高度相关。通过提供更好的活体发育金博宝188登录过程展开的可视化,改进允许欣赏新的原则,如机械力和组织环境如何决定细胞表型。仅从基因表达和表观遗传变异的检测模式来评估这些具有挑战性。作为一个具体的例子,在癌症进展过程中迁移细胞的组织成像揭示了细胞转移迁移方式,从间充质样到更快的变形虫样, 由于癌细胞和肿瘤微环境的伴随变化 (Wolf 等人,2007)。这表明癌细胞的环境强烈地影响着它的表观遗传状态 (Weigelt 和 Bissell,2008),这是表观遗传状态主要控制细胞表型这一普遍观念的逆转。

显微镜的进展: 超分辨率

直到最近,由于光的衍射极限,x-y 中低于 ~ 200 纳米和 z 中低于 ~ 500 纳米的光学分辨率是不可能的。这阻碍了对小长度尺度上发育生物学的许多方面的研究,例如小结构中的分子过程,如紧密连接突触、微丝和核孔。超分辨率显微镜的进步正在改变这一点,使纳米尺度现象的光学检测成为可能。一种突破空间分辨率极限的策略是采用受激发射来缩小显微镜的焦点。被称为受激发射耗尽 (STED) 显微镜 (Hell 和 Wichmann,1994),该技术使用一对重叠的同心激光束一起扫描, 第一束激发荧光团位于衍射受限的光斑内,第二束使用受激发射通过阻止其周边的荧光来缩小该光斑。STED 显微镜通常可以获得比传统荧光成像高 10 倍的分辨率,对诸如跟踪神经元中的突触囊泡、监测树突棘的形状变化等主题有了新的见解, 并测量质膜中的脂质动力学 (nazigerl 等人,2008; Eggeling 等人,2009)。另一种打破衍射约束的方法是饱和结构照明 microcrospy (SSIM) (Gustafsson,2005; Heintzmann 等人,2002)。它通过用一系列高空间频率的周期模式照亮样本来实现这一点,这些模式可以达到额定的激发强度。样本中的精细空间细节在小于 100 纳米的分辨率下,然后使用反褶积算法和傅里叶变换从原始图像中进行计算提取 (Schermelleh 等人,2008)。金博宝188登录

随着基于单分子的超分辨率技术的引入,更高的分辨率已经实现 (Patterson 等人,2010)。这些方法利用荧光的随机激活来检测和定位密集群体中的单荧光团。光激活定位显微镜 (PALM) (Betzig 等人,2006) 使用光可转换的荧光蛋白来完成这个,然而随机光学重建显微镜 (STORM) 依赖于光敏染料 (Rust 等人, 2006)。在这两种方法中,由过于密集而无法同时成像的光转换分子标记的结构可以通过纳米精度来分辨, 为细胞结构提供比以前光学显微镜更好的空间分辨率。尽管电子显微镜仍然可以提供比这些技术经常产生的图像 (~ 20 纳米) 更精细 (~ 1 纳米) 的分辨率, 因为 PALM/STORM 可以精确定位成千上万的荧光蛋白定位到亚细胞结构,它们提供了解开分子关系和化学计量的更大可能性,和蛋白质的簇特征 (Patterson 等人,2010)。这对于桥接结构和过程方法的二分法很重要,因为它允许确定蛋白质之间的空间排序并与它们的功能相关。例如,在提供 10 纳米 z 分辨率的干涉手掌方法中 (Shtengel 等人,2009), 局部粘连的功能结构 (允许细胞通过整合素受体与细胞外基质相互作用的 “feet”) 通过不同粘附成分相对于彼此和基质的精确定位被绘制出来(Kancha-nawong 等人,2010)。

数据分析和假设

随着光学显微镜成像在过去十年中的进步,收金博宝188登录集和分析其数据的方法也在进步。许多类型的图像数据集现在需要广泛的,通常基于模型的计算分析来解释。这是因为光学显微镜提供的数据的基本特征发生了巨大的变化。由于使用数字图像采集相机,图像通常以数字格式提供,每个图像像素具有指定的位数。因此,为了分析图像,需要图像数据分析工具,其中样本的表示通过计算重建。例如,在 FCS 中,由荧光物体移入和移出一个小体积产生的强度波动被数学分析和相关以揭示它们的大小、速度和相互作用 (Digman 和 Gratton, 2011)。即使在从常规共焦显微镜获得的图像中,数据也被数字化,并通过计算重建潜在的生物现实。因为图像是建立在数字像素输出之间的关系的基础上的,研究人员需要特别认识到他们在解释数据时的潜在假设 (Wilt 等人,2009)。数据本身既不属于结构也不属于过程阵营,似乎最有成效的是使用专注于结构和过程的假设的协同组合。

未来展望

成像的重大突破正在多个技术方面发生,影响了发育金博宝188登录生物学家检查纳米级、创建大规模组织重建以及对活体动物的细胞特性进行成像的能力。许多方法仍处于发展的早期阶段,但是随着这些方法的成熟,我们应该期待看到复杂的荧光标记策略与体内或超分辨率显微镜的更加复杂的组合。通过允许细胞内部和细胞之间的过程和关系的可视化,成像技术证实了不仅仅是表观遗传表达模式或结构负责发育中生物体的物理特性。同样重要的是基因产物之间的关系,它们产生复杂的自组织活动模式。利用不断增加的成像技术菜单,对这些过程及其潜在的结构元素进行高度协作的研究,为生物体的发育和功能提供了关键的见解。

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