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Grigorieff实验室

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目前的研究
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我们将冷冻EM应用于大分子组件的非结晶制剂(单个颗粒),并以最高可能的分辨率可视化其三维结构,以了解其分子机制,这些机制是细胞功能的基础。

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电子冷冻微镜(Cryo-EM)是一种可视化大分子及其组装的三维(3D)结构的多功能技术。使用冷冻EM,现在可以研究分子质量低至〜100 kDa(例如,膜蛋白)或高达数百个MDA(例如,大型病毒)的分子质量的原子结构。可以将组件可视化单倍,从而避免了对晶体的需求。这种“单粒子”方法需要极少量的材料,通常只有几十个皮科摩尔。

我们的实验室发展冷冻EM的新方法达到最高的分辨率(2Å或更高)。我们已经建立了一种新的电影成像协议,该协议利用了新型的摄像头,直金博宝188登录接电子检测器。使用该检测器,用于图像的总电子暴露可以在许多短电影框架上分布,而不是单个长时间的曝光。在曝光期间发生的任何样本运动(例如,横梁诱导的运动)随后都可以在电影中跟踪,并通过将电影框架对齐彼此对齐,从而“取消”,从而产生最终图像,这些图像没有模糊。

最近,我们开始开发一种检测原位分子和组件的方法(合作者:合作者:丹克实验室)。对生物学中的分子机制的充分理解需要细胞环境,以提供对局部环境的完整空间理解,并保留弱和短暂的相互作用,原本会错过。电子冷冻术的开发是为了可视化分子原位,并产生3D重建,具有可以使用模板匹配的功能来识别的特征。对于大型细胞质复合物(例如核糖体和蛋白酶体),这尤其成功,可以通过其独特的形状来识别。然而,在更密集的环境(例如核或细菌细胞)中,由于接近或与其他分子直接接触而遮盖了分子形状,从而使基于形状的模板匹配不可靠。为了解决这个问题,我们已经开始发展高分辨率模板匹配(HRTM),与高分辨率可见的内部分子特征匹配。即使在拥挤的环境中,内部特征仍然保持不同,因此HRTM可以确定分子身份。我们的方法使用直至最能保留高分辨率信号的直到标本的图像,依靠非常匹配的模板以高精度定位分子。

为了使用户容易访问我们的工具,我们设计了名为的开源软件CISTEM(用于传输电子显微镜的计算成像系金博宝188登录统)处理Cryo-EM数据。CISTEM具有用于提交作业,监视进度和显示结果的图形用户界面。它实施了完整的处理管道,包括单粒子冷冻EM所需的所有步骤,包括基于电影处理不熟悉,基于CTF的确定ctffind4,最大似然的2D分类,Ab-Initio 3D重建,自动再填充,3D分类和地图锐化。CISTEM针对CPU工作站进行了优化,并允许快速有效的处理,而无需大型计算机簇或专门的GPU硬件。

我们将单粒子技术应用于很难通过X射线晶体学和核磁共振(NMR)等传统技术研究的组件。例如,膜蛋白通常太大而无法进行NMR分析,或者难以结晶X射线晶体学。大蛋白质组件会带来其他问题,因为它们可以在组成和构象上发生恒定的变化。一个例子是核糖体(合作者:Korostelev实验室),在翻译过程中发生构象变化,并与不同的因素和配体结合。通常不形成晶体的另一类蛋白质组件包括纤维和丝,例如淀粉样纤维(合作者:Fändrich实验室)。我们还研究了高度对称的病毒,这些病毒代表了理想的测试标本的发展新的图像处理技术

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作为一个小组,我们努力在冷冻电子显微镜(Cryo-EM)中开发新的和改进的方法,以改善生物结构三维重建的分辨率。

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