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Grigorieff 实验室

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我们将 cryo-EM 应用于大分子组件的非结晶制剂 (单个颗粒),并以尽可能高的分辨率可视化其三维结构,以了解其作为细胞功能基础的分子机制。

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电子冷冻显微镜 (cryo-EM) 是一种通用的技术,用于可视化大分子及其组件的三维 (3D) 结构。有了 cryo-EM,现在可以研究分子量低至 ~ 100 kDa (例如,膜蛋白) 的组件的原子结构或者高达数百种 MDa (例如,一种大型病毒)。组件可以可视化单折,从而避免了对晶体的需要。这种 “单粒子” 方法需要非常少量的材料,通常只有几十个微微摩尔。

我们的实验室开发冷冻 EM 的新方法达到尽可能高的分辨率 (2 Å 或更好)。我们已经建立了一个新的电影成像协议,它利用了一种新型相机,直接电子探测器。使用该检测器,用于图像的总电子曝光可以分布在许多短电影帧上,而不是单金博宝188登录个长时间曝光。在曝光过程中发生的任何样本运动 (例如,光束诱导运动) 可以随后在电影中被跟踪,并通过将电影帧彼此对齐来 “撤消”, 从而产生无模糊的最终图像。

最近,我们开始开发一种在细胞内部原位检测分子和组装的方法 (合作者:登克实验室)。对生物学分子机制的全面理解需要细胞环境来提供对局部环境的完整的空间理解,并保持否则错过的微弱和短暂的相互作用。电子冷冻断层扫描被开发用于原位可视化分子,并产生具有可以使用模板匹配识别的特征的 3D 重建。这对于大型细胞质复合物尤其成功,例如核糖体和蛋白酶体,它们可以通过其独特的形状很容易地识别。然而,在更密集的环境中,如细胞核或细菌细胞,由于与其他分子的接近或直接接触,分子形状变得模糊,使得基于形状的模板匹配不可靠。为了解决这个问题,我们已经开始开发高分辨率的模板匹配 (HRTM),匹配高分辨率可见的内部分子特征。即使在拥挤的环境中,内部特征仍然不同,因此 HRTM 可以确定分子的身份。我们的方法使用未倾斜样本的图像,这最好地保留高分辨率信号,依靠紧密匹配的模板来高精度定位分子。

为了使我们的工具容易被用户访问,我们设计了名为透射电子显微镜的计算成像系统金博宝188登录处理冷冻电磁数据。CisTEM 具有用于提交作业、监控进度和显示结果的图形用户界面。它实现了一个完整的处理管道,包括单粒子冷冻 EM 所需的所有步骤,包括基于不模糊,基于 CTF 测定CTFFind4,最大似然 2D 分类,从头算 3D 重建,自动细化,3D 分类和地图锐化。CisTEM 针对 CPU 工作站进行了优化,并允许快速高效的处理,而无需大型计算机集群或专用 GPU 硬件。

我们将单粒子技术应用于难以通过更传统的技术如 x射线晶体学和核磁共振 (NMR) 来研究的组件。例如,膜蛋白对于核磁共振分析来说通常太大,或者对于 x射线晶体学来说很难结晶。大型蛋白质组装带来了额外的问题,因为它们可以在组成和构象上不断变化。一个例子是核糖体(合作者:Korost 实验室),在翻译过程中发生构象变化,并与不同的因素和配体结合。另一类通常不形成晶体的蛋白质组件包括纤维和细丝,例如淀粉样纤维(合作者:F ä ndrich 实验室)。我们还研究了高度对称的病毒,这些病毒代表了发展的理想样本新的图像处理技术

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作为一个团队,我们努力开发冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 中新的和改进的方法,以提高生物结构三维重建的分辨率。

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